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29.07.09 Krallenfrosch Xenopus ermöglicht einfache in vivo Tests von Wirkstoffen

Testverfahren für angiogenese-aktive Wirkstoffe

Transparente Xenopus Kaulquappen machen Blutgefässdefekte sichtbar

Die Suche nach Wirkstoffen zur Behandlung von Gefässkrankheiten und ein In-Vivo-Test in einem ganzen Tier auf einen Schlag: dieses Kunststück gelang ETH-Forschern am Institut für Pharmazeutische Wissenschaften mit Hilfe des Krallenfrosches Xenopus. Pharmafirmen horchen auf.

Christoph Meier (ETHZ)

Blutgefässdefekte in Xenopus Kaulquappen sichtbar gemacht. Die Wirksubstanz mit der Abkürzung Cyclo-7 (obere Reihe) verhindert die Bildung neuer Blutgefässe (Pfeil). Zum Vergleich: Bilder der Kontroll-Tiere (untere Reihe).
Quelle: Roland Kälin , ETH Zürich

Wie findet man einen neuen Wirkstoffkandidaten, welcher als Grundlage für die Entwicklung eines wirksamen Medikaments dienen kann? Diese Frage - deren Antwort Kosten in Millionenhöhe verursacht - ist grundlegend für die Pharmazeutischen Wissenschaften und die Pharmazeutische Industrie. Entsprechend intensiv wird nach neuen, kostengünstigen und aussagekräftigen Screening-Verfahren gesucht.

Doch die Wirkstoffsuche ist alles andere als trivial. Der heute übliche Ansatz beinhaltet, dass zuerst die biochemischen Prozesse einer Krankheit aufgeklärt werden, dann ein Angriffspunkt identifiziert und ein Nachweis-System entwickelt wird, welches erlaubt, verschiedene Wirkstoffkandidaten zu prüfen. Ein solches Verfahren ist aber sehr aufwändig und braucht viel Vorwissen.

Grosser Sprung nach vorne mit Frosch

Einfacher wäre es, wenn man bereits einen geeigneten Organismus hätte, dem man Wirksubstanzen verabreichen kann und der eine einfach ablesbare Reaktion aufweist, die zeigt, welche Wirksubstanzen ein bestimmtes Organ oder seine Entwicklung beeinflussen können. Der Vorteil eines solches Systems bestünde darin, dass das Screening-Verfahren direkt an einen Versuch im ganzen Tier gekoppelt ist, ein Schritt, der bei den meisten Medikamentenentwicklungen erst viel später erfolgt.

Ein grosser Sprung nach vorne zu einem solchen einfachen Testverfahren ist der Gruppe von Professor André Brändli vom Institut für Pharmazeutische Wissenschaften der ETH Zürich mit Kaulquappen des Krallenfrosches Xenopus gelungen. André Brändli, der im Juli an die Ludwig-Maximilians-Universität München berufen wurde, konnte in diesem Tiermodell ein Testverfahren für Wirksubstanzen entwickeln, welche die Gefässbildung beeinflussen. Die entsprechende Studie erschien kürzlich in der Fachzeitschrift Blood. Wirksubstanzen gegen Gefässbildung sind unter anderem von grosser Bedeutung, da sie auch gegen verschiedene Krebsformen eingesetzt werden können. Denn Tumore sind abhängig von neu gebildeten Gefässen..

Schema des zweistufigen Screening-Verfahrens für Gefässdefekte in Xenopus Kaulquappen.
Quelle: Roland Kälin , ETH Zürich

Zweistufiger Test

Doch wie sieht dieses Testverfahren aus? Brändli und sein Team verwenden dafür die wenige Millimeter grossen Kaulquappen des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus. Die Kaulquappen sind dabei knapp anderthalb Tage alt und damit in der Entwicklungsphase, in der sie ihre Gefässe ausbilden. Da die Haut der Kaulquappen für kleine wasserlösliche Moleküle durchlässig ist, können die Forscher die Wirksubstanzen direkt in die Flüssigkeit geben, in der die Kaulquappen umher schwimmen. Danach testen sie die Tiere ohne weitere Behandlung unter dem Mikroskop auf erkennbare Hinweise, die auf Veränderungen im Gefässsystem schliessen lassen.

Konkret suchen sie in einem ersten Schritt nach Ödemen, also Gewebeschwellungen, die bei Defekten der Gefäss- oder Nierenbildung auftreten. Diese sind leicht erkennbar, da Xenopus-Kaulquappen transparent sind. Gibt es andere Auffälligkeiten, sei es, dass die Kaulquappen sterben oder spezielle Pigmentierungen aufweisen, halten die Forscher dies ebenfalls fest. Bei den positiven Befunden analysieren die Wissenschaftler in einem zweiten Schritt die Gefässbildung noch genauer, indem sie spezifisch die Lymph- und Blutgefässe mit Farbstoffen markieren. Danach können sie wiederum unter dem Mikroskop die genauen Veränderungen, sei es die Reduktion oder das Fehlen eines Gefässes, bestimmen.

Frosch findet zur Bibliothek

Die Idee für dieses elegante Testverfahren trug André Brändli schon mehrere Jahre mit sich herum. Als Entwicklungsbiologe, der schon länger mit Xenopus arbeitete, kannte er die Vorteile seines Studienobjektes: kurze Generationszeit, leichte Handhabbarkeit und kostengünstige Verfügbarkeit von Tausenden von Kaulquappen. Bedeutsam ist auch, dass aus Kaulquappen Wirbeltiere mit vier Extremitäten entstehen, was viele ähnliche Entwicklungsprozesse wie bei Säugetieren zur Folge hat.

Um zu beweisen, dass sich die Kaulquappen wirklich für ein Wirkstoff-Screening eignen, brauchte es jedoch mehr, nämlich genügend chemische Substanzen. Diese standen Brändli ab 2006 zur Verfügung, als das Institut für Pharmazeutische Wissenschaften verschiedene chemische Bibliotheken, also Sammlungen verschiedener chemischer Stoffe, anschaffte.

Diese komfortable Situation nutzte der Forscher und testete mit seinem Team 1280 Substanzen, die als bioaktiv bekannt waren. Es zeigte sich, dass 32 davon die Gefässbildung beeinflussen. Einige davon wirken sowohl auf die Lymph- und die Blutgefässe, andere nur auf jeweils ein Gefässsystem. Dass es Stoffe gibt, die spezifisch das Lymphsystem beeinflussen, ist dabei von besonderem Interesse, denn bis anhin fehlte ein Testsystem für diesen Gefässtyp.

Die Güte des Screenings zeigte sich aber nicht nur an der Zahl der 32 aktiven Substanzen und den Unterscheidungsmöglichkeiten, sondern auch daran, dass das Testverfahren alle bereits bekannten Gefässsystem-relevanten Wirkstoffe zuverlässig nachwies. Um zu zeigen, dass die Wirkstoffe nicht nur in Kaulquappen sondern auch in Säugetieren aktiv sind, spannte Brändli mit seinem Institutskollegen, Professor Michael Detmar, einem Spezialisten für die Gefässbildung bei Mäusen, zusammen. Detmar und seinem Team gelang dann der Beweis, dass ein bestimmter Wirkstoff (7-Chloro-4-Hydroxy-2-Phenyl-1,8-Naphthyridin), der in Xenopus die Gefässbildung hemmt, auch in der Maus einer künstlich stimulierten Gefässbildung entgegenwirkt. Damit war die Aussagekraft des Xenopus-Testverfahrens auch für Säugetiere bewiesen.

Kann Xenopus-Screening Industrie überzeugen?

Brändli ist überzeugt, mit Xenopus ein sehr effizientes und sensitives In-Vivo-Testverfahren für die Entdeckung von neuen Wirksubstanzen, welche die Gefässbildung beeinflussen können, entwickelt zu haben. Sein zur Patentierung angemeldetes Testverfahren demonstriere, dass man mit solchen Screens auch auf Substanzen stosse, die erst in einem ganzen Organismus wirksam würden und die daher in In-Vitro-Testverfahren mit Zellkulturen nicht gefunden würden. Doch nicht nur der Forscher ist überzeugt von Wirkstoff-Screens in Xenopus Kaulquappen. Bereits haben auch verschiedene in- und ausländische Pharmafirmen ihr Interesse am neuen Testverfahren bekundet.

Brändli hofft nun, eine langfristige Partnerschaft mit der Pharmazeutischen Industrie aufbauen zu können. In dieser sollen die im „Xenopus-Test“ gefundenen Wirkstoffkandidaten zu optimierten Varianten weiterentwickelt werden, welche schliesslich in die klinische Prüfung gehen können. Brändli macht sich jedoch keine Illusionen: Auch wenn das Auffinden eines Wirksubstanz-Kandidaten und der erste Test im Tier wichtige und entscheidende Schritte darstellen, bleibt der Weg zum zugelassenen Medikament weiterhin weit und steinig.

Diskussion (R. Müller, 29.07.2009)

Die heutige Medikamentenentwicklung ist bestimmt teuer, doch kann lediglich ein vertieftes Verständnis molekularer Vorgänge, zu selektiv wirkenden Wirkstoffen führen. Der Xenopus-Test ist gut, um Wirkstoffkandidaten zu finden, aber bei einem Screening von tausenden Substanzen bleibt bei den Substanzen die wichtige Frage offen, wie denn die Substanz überhaupt wirkt. Dass gerade im Angiogenese-Bereich mehr als nur ein Schlüsselfaktor mitspielt, wurde erst kürzlich beschrieben ("Schalter" für Wachstum von Blutgefäßen identifiziert). Ein einfaches Testmodell führt also womöglich schon zu einigen Hits, aber gibt keinerlei Auskunft, welche Enzyme und weiteren molekularen Targets involviert sind. Für Wirkstoff-Optimierungen ist dieses Wissen aber unerlässlich. Abgesehen davon, ist es ethisch fragwürdig, tausende von Verbindungen bei Wirbeltieren "auf gut Glück" zu testen. Daher muss genau definiert und diskutiert werden, in welcher Entwicklungsphase und mit welcher Anzahl von Substanzen der Test durchgeführt wird.

Quelle:

ETH Life

An in vivo chemical library screen in Xenopus tadpoles reveals novel pathways involved in angiogenesis and lymphangiogenesis
R. E. Kälin, et. al, Blood 2009, DOI: 10.1182/blood-2009-03-211771

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Krallenfrosch Xenopus ermöglicht einfache in vivo Tests von Wirkstoffen
(URL: http://www.organische-chemie.ch/chemie/2009jul/xenopus.shtm)

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